前言

本標準按 GB/T 1.1-2009給出的規則起草。本標準由中國獸醫協會提出并歸口。本標準起草單位:中國動物疫病預防控制中心、中國獸醫藥品監察所、中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、中國農業科學院蘭州獸醫研究所、北京海關。

非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法

1、范圍

本標準規定了非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法的試劑、儀器和耗材、操作步驟、結果判定、實驗室生物安全等技術要求。

本標準適用于豬脾臟、淋巴結、血液等組織和血粉中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。

2、規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是*的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB 19489 實驗室 生物安全通用要求

NY/T 541 獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范

3、試劑

3.1DNA提取試劑

DNA提取試劑的配制見附錄A，或選取商品化的病毒DNA提取試劑盒并參照說明書進行DNA提取。

3.2 2 × PCR緩沖液

2× PCR緩沖液的配制見附錄A。

3.3引物探針

3.3.1采用針對非洲豬瘟病毒VP72基因(核苷酸序列見附錄B)的引物及探針:

上游引物ASF-CADC-rPCRF:5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'

下游引物ASF-CADC-rPCRR:5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'

熒光探針ASF-CADC-Probe:5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'

3.3.2可以使用世界動物衛生組織(OIE)在陸生動物診斷技術和疫苗手冊(Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals)第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探針，并按照手冊中規定的檢測程序和判定標準操作:

上游引物ASF-OIE-rPCRF:5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'

下游引物ASF-OIE-rPCRR:

5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'

熒光探針ASF-OIE-Probe:

5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'

3.3.3使用國家農業行政主管部門批準的其他引物、探針，應對檢測程序和判定標準作相應調整。

3.4 陰性及陽性對照

陰性及陽性對照的制備方法見附錄C。

3.5 其他試劑

消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、無菌無核酸酶水、0.01mol/L PBS(pH7.2)。

消毒液配制見附錄A， 0.01mol/L PBS配制見附錄A。

4、儀器和耗材

分析天平(感量0.1 mg)、高速臺式冷凍離心機(高離心速度不低于12 000 r/min)、冰盒、實時熒光PCR儀及配套反應管(板)、組織研磨器、-20℃冰箱、可調移液器(2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL)、1.5mL離心管(無核酸酶)。

5、操作步驟

5.1 樣品采集及運輸

樣品采集及運輸按照NY/T 541的規定執行，采集豬的脾臟、淋巴結、血液等組織材料或血粉用于檢測，樣品應在冷藏條件下盡快運輸至實驗室，避免反復凍融。采樣時應穿戴個人生物安全防護裝備，實施現場消毒和廢棄物處理。

5.2 樣品處理

檢測前樣品應在二級生物安全柜中處理。取0.1g~0.2g組織或血粉，經研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS(pH7.2)制成勻漿，經10 000 r/min離心取上清;全血、血清樣品直接取1mL，置于1.5 mL離心管內蓋緊管帽。將上述處理的樣品置于60℃條件下滅活30min。

5.3 樣品保存

采集或處理好的樣品在2℃~8℃條件下保存應不超過24 h;如需長期保存，應放置-70℃冰箱，但應避免反復凍融(凍融不超過3次)。

5.4 病毒DNA提取

5.4.1 DNA提取應在樣本制備區內采用以下方法進行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑，則按照試劑說明書操作。

5.4.2 待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數總和用n表示，取n個滅菌1.5 mL離心管，逐管編號。

5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分別加入待測樣品、陰性對照和陽性對照各200μL，1份樣品換用1個吸頭，混勻器上震蕩混勻5s。于4℃~25℃條件下，13 000 r/min離心10 min。DNA提取液1見附錄A。

5.4.4 盡可能吸取上清、棄去，吸頭不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混勻器上震蕩混勻5 s。于4℃~25℃條件下，2 000 r/min離心10s。DNA提取液2見附錄A。

5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。

5.4.6 加入90μL無DNA酶的滅菌去離子水，13 000 r/min離心10 min，上清即為提取的DNA，-20℃保存備用。無DNA酶的滅菌去離子水見附錄A。

5.5 實時熒光PCR操作

5.5.1 在反應混合物配制區、樣品制備區和檢測區分別進行5.5.2~5.5.4。

5.5.2 每個檢測反應體系需使用20μL實時熒光PCR反應液。根據5.4.2中設定的n值，按附錄D配制反應液，充分混勻后分裝，每個PCR反應管20μL。轉移PCR反應管至樣品制備區。

5.5.3 在上述5.5.2的反應管中分別加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管總體積達到25 μL，記錄反應管對應的樣品編號。蓋緊管蓋后，瞬時離心。

5.5.4 將5.5.3加樣后的反應管放入實時熒光PCR檢測儀內，記錄反應管擺放順序。選定5-羧基熒光素(FAM)作為報告基團，小溝結合物(MGB)為淬滅基團，反應參數設置如下:預變性95℃/3 min;95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45個循環;在每次循環的60℃退火延伸時收集熒光。試驗結束后，根據收集的Ct值和熒光曲線判定結果。

6、結果判定

6.1 結果分析條件設定

實時熒光PCR檢測閾值設定原則:閾值線超過陰性對照擴增曲線的高點，且相交于陽性對照擴增曲線進入指數增長期的拐點，或根據儀器噪聲情況進行調整。每個樣品反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數即為Ct值。

6.2 結果描述及判定

當陽性對照Ct值≤28.0且出現典型擴增曲線，陰性對照無Ct值無擴增曲線時，實驗成立，實例參考附錄E。當被檢樣品出現典型的擴增曲線且Ct值≤38.0時，判為非洲豬瘟病毒核酸陽性;被檢樣品無Ct值，判為非洲豬瘟病毒核酸陰性;對于Ct值＞38.0的樣品且出現典型的擴增曲線，應重檢，重檢仍出現上述結果的判為陽性，否則判為陰性。